Faktor interferensi dalam reaksi PCR

Selama reaksi PCR, beberapa faktor pengganggu sering ditemui.
Karena sensitivitas PCR yang sangat tinggi, kontaminasi dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi hasil PCR dan dapat menghasilkan hasil positif palsu.
Sama kritisnya adalah berbagai sumber yang mengarah pada hasil negatif palsu.Jika satu atau lebih bagian penting dari campuran PCR atau reaksi amplifikasi itu sendiri dihambat atau diganggu, uji diagnostik dapat dihambat.Hal ini dapat menyebabkan penurunan efisiensi dan bahkan hasil negatif palsu.
Selain penghambatan, hilangnya integritas asam nukleat target dapat terjadi karena pengiriman dan/atau kondisi penyimpanan sebelum persiapan sampel.Secara khusus, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel dan asam nukleat.Fiksasi sel dan jaringan dan penyematan parafin adalah penyebab fragmentasi DNA yang terkenal dan masalah yang terus-menerus (lihat Gambar 1 dan 2).Dalam kasus ini, bahkan isolasi dan pemurnian yang optimal tidak akan membantu.

Gambar 1 |Efek imobilisasi pada integritas DNA
Elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa kualitas DNA yang diisolasi dari bagian parafin otopsi sangat bervariasi.DNA dengan panjang fragmen rata-rata berbeda terdapat dalam ekstrak tergantung pada metode fiksasi.DNA diawetkan hanya ketika difiksasi dalam sampel beku asli dan dalam formalin netral buffer.Penggunaan fiksatif Bouin yang sangat asam atau formalin yang mengandung asam format yang tidak mengandung buffer mengakibatkan hilangnya DNA secara signifikan.Fraksi yang tersisa sangat terfragmentasi.
Di sebelah kiri, panjang fragmen dinyatakan dalam pasangan kilobase (kbp)

Gambar 2 |Hilangnya integritas target asam nukleat
(a) Celah 3′-5′ pada kedua untaian akan menghasilkan kerusakan pada DNA target.sintesis DNA masih akan terjadi pada fragmen kecil.Namun, jika situs anil primer hilang pada fragmen DNA, hanya amplifikasi linier yang terjadi.Dalam kasus yang paling menguntungkan, fragmen mungkin satu sama lain, tetapi hasilnya akan kecil dan di bawah tingkat deteksi.
(b) Hilangnya basa, terutama karena depurinasi dan pembentukan dimer timidin, menyebabkan penurunan jumlah ikatan H dan penurunan Tm.Selama fase pemanasan yang memanjang, primer akan meleleh dari DNA matriks dan tidak akan anil bahkan dalam kondisi yang kurang ketat.
(c) Basa timin yang berdekatan membentuk dimer TT.
Masalah umum lainnya yang sering terjadi pada diagnostik molekuler adalah pelepasan asam nukleat target yang kurang optimal dibandingkan dengan ekstraksi fenol-kloroform.Dalam kasus ekstrim, ini dapat dikaitkan dengan negatif palsu.Banyak waktu dapat dihemat dengan mendidihkan lisis atau pencernaan enzimatik dari sisa-sisa sel, tetapi metode ini sering menghasilkan sensitivitas PCR yang rendah karena pelepasan asam nukleat yang tidak mencukupi.

Penghambatan aktivitas polimerase selama amplifikasi

Secara umum, inhibisi digunakan sebagai konsep wadah untuk menggambarkan semua faktor yang menyebabkan hasil PCR kurang optimal.Dalam pengertian biokimia yang ketat, penghambatan terbatas pada aktivitas enzim, yaitu, mengurangi atau mencegah konversi substrat-produk melalui interaksi dengan situs aktif polimerase DNA atau kofaktornya (misalnya, Mg2+ untuk Taq DNA polimerase).
Komponen dalam sampel atau berbagai buffer dan ekstrak yang mengandung reagen dapat secara langsung menghambat enzim atau menjebak kofaktornya (misalnya EDTA), sehingga menonaktifkan polimerase dan pada gilirannya menyebabkan penurunan atau hasil PCR negatif palsu.
Namun, banyak interaksi antara komponen reaksi dan asam nukleat yang mengandung target juga ditetapkan sebagai 'penghambat PCR'.Setelah integritas sel terganggu oleh isolasi dan asam nukleat dilepaskan, interaksi antara sampel dan larutan sekitarnya dan fase padat dapat terjadi.Misalnya, 'pemulung' dapat mengikat DNA beruntai tunggal atau ganda melalui interaksi non-kovalen dan mengganggu isolasi dan pemurnian dengan mengurangi jumlah target yang akhirnya mencapai bejana reaksi PCR.
Secara umum, penghambat PCR terdapat di sebagian besar cairan tubuh dan reagen yang digunakan untuk uji diagnostik klinis (urea dalam urin, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen diet (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen dalam lingkungan (fenol). , logam berat)

Inhibitor PCR yang lebih umum dapat ditemukan pada bakteri dan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul pengikat DNA dari matriks jaringan dan peralatan laboratorium seperti sarung tangan dan plastik.Pemurnian asam nukleat selama atau setelah ekstraksi adalah metode yang disukai untuk menghilangkan penghambat PCR.
Saat ini, berbagai peralatan ekstraksi otomatis dapat menggantikan banyak protokol manual, tetapi pemulihan 100% dan/atau pemurnian target tidak pernah tercapai.Inhibitor potensial mungkin masih ada dalam asam nukleat yang dimurnikan atau mungkin sudah berpengaruh.Strategi yang berbeda ada untuk mengurangi dampak inhibitor.Pemilihan polimerase yang tepat dapat berdampak signifikan pada aktivitas inhibitor.Metode lain yang telah terbukti untuk mengurangi penghambatan PCR adalah dengan meningkatkan konsentrasi polimerase atau menggunakan aditif seperti BSA.
Penghambatan reaksi PCR dapat ditunjukkan dengan penggunaan kontrol kualitas proses internal (IPC).
Perawatan harus diambil untuk menghilangkan semua reagen dan larutan lain dalam kit ekstraksi, seperti etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol dan fenol, dari isolat asam nukleat dengan langkah pencucian menyeluruh.Bergantung pada konsentrasinya, mereka dapat mengaktifkan atau menghambat PCR.