Faktor interferensi dalam reaksi PCR

Selama reaksi PCR, beberapa faktor yang mengganggu sering ditemui.
Karena sensitivitas PCR yang sangat tinggi, kontaminasi dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi hasil PCR dan dapat memberikan hasil positif palsu.
Yang juga sama pentingnya adalah berbagai sumber yang memberikan hasil negatif palsu. Jika satu atau lebih bagian penting dari campuran PCR atau reaksi amplifikasi itu sendiri terhambat atau terganggu, pengujian diagnostik dapat terhambat. Hal ini dapat menyebabkan berkurangnya efisiensi dan bahkan hasil negatif palsu.
Selain penghambatan, hilangnya integritas asam nukleat target dapat terjadi karena kondisi pengiriman dan/atau penyimpanan sebelum persiapan sampel. Khususnya, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel dan asam nukleat. Fiksasi sel dan jaringan serta penanaman parafin merupakan penyebab fragmentasi DNA yang diketahui dan merupakan masalah yang terus-menerus (lihat Gambar 1 dan 2). Dalam kasus ini, isolasi dan pemurnian yang optimal pun tidak akan membantu.

Gambar 1 | Pengaruh imobilisasi terhadap integritas DNA
Elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa kualitas DNA yang diisolasi dari bagian parafin pada otopsi sangat bervariasi. DNA dengan panjang fragmen rata-rata berbeda terdapat dalam ekstrak tergantung pada metode fiksasi. DNA dipertahankan hanya jika difiksasi dalam sampel beku asli dan dalam formalin netral yang disangga. Penggunaan fiksatif Bouin yang bersifat asam kuat atau tanpa buffer, formalin yang mengandung asam format mengakibatkan hilangnya DNA secara signifikan. Fraksi yang tersisa sangat terfragmentasi.
Di sebelah kiri, panjang fragmen dinyatakan dalam kilobase pair (kbp)

Gambar 2 | Hilangnya integritas target asam nukleat
(a) Celah 3′-5′ pada kedua untai akan mengakibatkan putusnya DNA target. sintesis DNA akan tetap terjadi pada fragmen kecil tersebut. Namun, jika situs anil primer tidak ada pada fragmen DNA, hanya terjadi amplifikasi linier. Dalam kasus yang paling menguntungkan, fragmen-fragmen tersebut dapat saling jenuh satu sama lain, namun hasilnya akan kecil dan di bawah tingkat deteksi.
(b) Hilangnya basa, terutama karena depurinasi dan pembentukan dimer timidin, menyebabkan penurunan jumlah ikatan H dan penurunan Tm. Selama fase pemanasan yang memanjang, primer akan meleleh dari matriks DNA dan tidak akan mengalami anil bahkan dalam kondisi yang tidak terlalu ketat.
(c) Basa timin yang berdekatan membentuk dimer TT.
Masalah umum lainnya yang sering terjadi dalam diagnostik molekuler adalah pelepasan asam nukleat target yang kurang optimal dibandingkan dengan ekstraksi fenol-kloroform. Dalam kasus ekstrim, hal ini dapat dikaitkan dengan hasil negatif palsu. Banyak waktu yang dapat dihemat dengan merebus lisis atau pencernaan enzimatik dari sisa-sisa sel, tetapi metode ini sering kali menghasilkan sensitivitas PCR yang rendah karena pelepasan asam nukleat yang tidak mencukupi.

Penghambatan aktivitas polimerase selama amplifikasi

Secara umum, inhibisi digunakan sebagai konsep wadah untuk menggambarkan seluruh faktor yang menyebabkan hasil PCR kurang optimal. Dalam pengertian biokimia yang ketat, penghambatan terbatas pada aktivitas enzim, yaitu mengurangi atau mencegah konversi produk substrat melalui interaksi dengan situs aktif DNA polimerase atau kofaktornya (misalnya, Mg2+ untuk Taq DNA polimerase).
Komponen dalam sampel atau berbagai buffer dan ekstrak yang mengandung reagen dapat secara langsung menghambat enzim atau menjebak kofaktornya (misalnya EDTA), sehingga menonaktifkan polimerase dan pada gilirannya menyebabkan penurunan atau hasil PCR negatif palsu.
Namun, banyak interaksi antara komponen reaksi dan asam nukleat yang mengandung target juga disebut sebagai 'inhibitor PCR'. Setelah integritas sel terganggu oleh isolasi dan asam nukleat dilepaskan, interaksi antara sampel dan larutan di sekitarnya serta fase padat dapat terjadi. Misalnya, 'pemulung' dapat mengikat DNA beruntai tunggal atau ganda melalui interaksi non-kovalen dan mengganggu isolasi dan pemurnian dengan mengurangi jumlah target yang akhirnya mencapai wadah reaksi PCR.
Secara umum, inhibitor PCR terdapat di sebagian besar cairan tubuh dan reagen yang digunakan untuk uji diagnostik klinis (urea dalam urin, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen makanan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen di lingkungan (fenol). , logam berat)

Inhibitor PCR yang lebih umum dapat ditemukan pada bakteri dan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul pengikat DNA pada matriks jaringan, dan peralatan laboratorium seperti sarung tangan dan plastik. Pemurnian asam nukleat selama atau setelah ekstraksi merupakan metode yang disukai untuk menghilangkan inhibitor PCR.
Saat ini, berbagai peralatan ekstraksi otomatis dapat menggantikan banyak protokol manual, namun pemulihan 100% dan/atau pemurnian target belum pernah tercapai. Inhibitor potensial mungkin masih ada dalam asam nukleat yang dimurnikan atau mungkin sudah mulai bekerja. Ada strategi berbeda untuk mengurangi dampak inhibitor. Pemilihan polimerase yang tepat dapat mempunyai dampak yang signifikan terhadap aktivitas inhibitor. Metode lain yang terbukti mengurangi penghambatan PCR adalah meningkatkan konsentrasi polimerase atau menerapkan aditif seperti BSA.
Penghambatan reaksi PCR dapat ditunjukkan dengan penggunaan pengendalian kualitas proses internal (IPC).
Harus hati-hati untuk menghilangkan semua reagen dan larutan lain dalam kit ekstraksi, seperti etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol dan fenol, dari isolat asam nukleat dengan langkah pencucian menyeluruh. Tergantung pada konsentrasinya, mereka dapat mengaktifkan atau menghambat PCR.