Faktor-faktor pengganggu dalam reaksi PCR

Selama reaksi PCR, beberapa faktor pengganggu sering ditemui.
Karena sensitivitas PCR yang sangat tinggi, kontaminasi dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang memengaruhi hasil PCR dan dapat menghasilkan hasil positif palsu.
Sama pentingnya adalah berbagai sumber yang menyebabkan hasil negatif palsu. Jika satu atau lebih bagian penting dari campuran PCR atau reaksi amplifikasi itu sendiri terhambat atau terganggu, pengujian diagnostik dapat terhambat. Hal ini dapat menyebabkan penurunan efisiensi dan bahkan hasil negatif palsu.
Selain penghambatan, hilangnya integritas asam nukleat target dapat terjadi karena kondisi pengiriman dan/atau penyimpanan sebelum persiapan sampel. Secara khusus, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel dan asam nukleat. Fiksasi sel dan jaringan serta pengemasan parafin merupakan penyebab fragmentasi DNA yang sudah dikenal dan merupakan masalah yang terus berlanjut (lihat Gambar 1 dan 2). Dalam kasus ini, bahkan isolasi dan pemurnian optimal pun tidak akan membantu.

Gambar 1 | Pengaruh imobilisasi terhadap integritas DNA
Elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa kualitas DNA yang diisolasi dari potongan parafin otopsi sangat bervariasi. DNA dengan panjang fragmen rata-rata yang berbeda terdapat dalam ekstrak tergantung pada metode fiksasi. DNA hanya terawetkan ketika difiksasi dalam sampel beku asli dan dalam formalin netral yang dibuffer. Penggunaan fiksatif Bouin yang sangat asam atau formalin yang tidak dibuffer dan mengandung asam format mengakibatkan hilangnya DNA secara signifikan. Fraksi yang tersisa sangat terfragmentasi.
Di sebelah kiri, panjang fragmen dinyatakan dalam kilobase pasangan (kbp).

Gambar 2 | Hilangnya integritas target asam nukleat
(a) Celah 3′-5′ pada kedua untai akan mengakibatkan putusnya DNA target. Sintesis DNA masih akan terjadi pada fragmen kecil. Namun, jika situs penempelan primer hilang pada fragmen DNA, hanya amplifikasi linier yang terjadi. Dalam kasus yang paling menguntungkan, fragmen-fragmen tersebut dapat saling menjenuhkan kembali, tetapi hasilnya akan kecil dan di bawah tingkat deteksi.
(b) Hilangnya basa, terutama karena depurinasi dan pembentukan dimer timidin, menyebabkan penurunan jumlah ikatan H dan penurunan Tm. Selama fase pemanasan yang berkepanjangan, primer akan meleleh dari DNA matriks dan tidak akan berikatan bahkan dalam kondisi yang kurang ketat.
(c) Basa timin yang bersebelahan membentuk dimer TT.
Masalah umum lain yang sering terjadi dalam diagnostik molekuler adalah pelepasan asam nukleat target yang kurang optimal dibandingkan dengan ekstraksi fenol-kloroform. Dalam kasus ekstrem, hal ini dapat dikaitkan dengan hasil negatif palsu. Banyak waktu dapat dihemat dengan lisis mendidih atau pencernaan enzimatik terhadap sisa-sisa sel, tetapi metode ini seringkali menghasilkan sensitivitas PCR yang rendah karena pelepasan asam nukleat yang tidak mencukupi.

Penghambatan aktivitas polimerase selama amplifikasi

Secara umum, inhibisi digunakan sebagai konsep umum untuk menggambarkan semua faktor yang menyebabkan hasil PCR yang suboptimal. Dalam pengertian biokimia murni, inhibisi terbatas pada aktivitas enzim, yaitu, mengurangi atau mencegah konversi substrat-produk melalui interaksi dengan situs aktif DNA polimerase atau kofaktornya (misalnya, Mg2+ untuk Taq DNA polimerase).
Komponen dalam sampel atau berbagai larutan penyangga dan ekstrak yang mengandung reagen dapat secara langsung menghambat enzim atau menjebak kofaktornya (misalnya EDTA), sehingga menonaktifkan polimerase dan pada gilirannya menyebabkan penurunan atau hasil PCR negatif palsu.
Namun, banyak interaksi antara komponen reaksi dan asam nukleat yang mengandung target juga disebut sebagai 'inhibitor PCR'. Setelah integritas sel terganggu oleh isolasi dan asam nukleat dilepaskan, interaksi antara sampel dan larutan serta fase padat di sekitarnya dapat terjadi. Misalnya, 'scavenger' dapat mengikat DNA untai tunggal atau ganda melalui interaksi non-kovalen dan mengganggu isolasi dan pemurnian dengan mengurangi jumlah target yang akhirnya mencapai wadah reaksi PCR.
Secara umum, inhibitor PCR terdapat di sebagian besar cairan tubuh dan reagen yang digunakan untuk tes diagnostik klinis (urea dalam urin, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen makanan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen di lingkungan (fenol, logam berat).

Inhibitor PCR yang lebih umum dapat ditemukan pada bakteri dan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul pengikat DNA dari matriks jaringan, dan peralatan laboratorium seperti sarung tangan dan plastik. Pemurnian asam nukleat selama atau setelah ekstraksi adalah metode yang lebih disukai untuk menghilangkan inhibitor PCR.
Saat ini, berbagai peralatan ekstraksi otomatis dapat menggantikan banyak protokol manual, tetapi pemulihan dan/atau pemurnian target 100% belum pernah tercapai. Inhibitor potensial mungkin masih ada dalam asam nukleat yang dimurnikan atau mungkin telah berpengaruh. Berbagai strategi ada untuk mengurangi dampak inhibitor. Pemilihan polimerase yang tepat dapat berdampak signifikan pada aktivitas inhibitor. Metode lain yang telah terbukti untuk mengurangi inhibisi PCR adalah meningkatkan konsentrasi polimerase atau menggunakan aditif seperti BSA.
Penghambatan reaksi PCR dapat ditunjukkan dengan menggunakan kontrol kualitas proses internal (IPC).
Perlu diperhatikan untuk menghilangkan semua reagen dan larutan lain dalam kit ekstraksi, seperti etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol, dan fenol, dari isolat asam nukleat dengan langkah pencucian yang menyeluruh. Tergantung pada konsentrasinya, zat-zat tersebut dapat mengaktifkan atau menghambat PCR.