Faktor gangguan dalam reaksi PCR

Selama reaksi PCR, beberapa faktor yang mengganggu sering ditemui.
Karena sensitivitas PCR yang sangat tinggi, kontaminasi dianggap sebagai salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi hasil PCR dan dapat menghasilkan hasil positif palsu.
Yang sama pentingnya adalah berbagai sumber yang mengarah pada hasil negatif palsu. Jika satu atau lebih bagian penting dari campuran PCR atau reaksi amplifikasi itu sendiri dihambat atau terganggu, uji diagnostik dapat dihambat. Ini dapat menyebabkan berkurangnya efisiensi dan bahkan hasil negatif palsu.
Selain penghambatan, hilangnya integritas asam nukleat target dapat terjadi karena pengiriman dan/atau kondisi penyimpanan sebelum persiapan sampel. Secara khusus, suhu tinggi atau penyimpanan yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel dan asam nukleat. Fiksasi sel dan jaringan dan embedding parafin adalah penyebab fragmentasi DNA yang terkenal dan masalah yang persisten (lihat Gambar 1 dan 2). Dalam kasus ini, bahkan isolasi dan pemurnian yang optimal tidak akan membantu.

Gambar 1 | Efek imobilisasi pada integritas DNA
Elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa kualitas DNA yang diisolasi dari bagian -bagian otopsi autopsi sangat bervariasi. DNA dengan panjang fragmen rata -rata yang berbeda hadir dalam ekstrak tergantung pada metode fiksasi. DNA dilestarikan hanya ketika difiksasi dalam sampel beku asli dan dalam formalin netral buffer. Penggunaan formalin bouin yang sangat asam atau tidak terikat, formalin yang mengandung asam format mengakibatkan hilangnya DNA yang signifikan. Fraksi yang tersisa sangat terfragmentasi.
Di sebelah kiri, panjang fragmen diekspresikan dalam pasangan kilobase (KBP)

Gambar 2 | Hilangnya integritas target asam nukleat
(A) Celah 3′-5 ′ pada kedua untaian akan menghasilkan istirahat pada DNA target. Sintesis DNA masih akan terjadi pada fragmen kecil. Namun, jika situs annealing primer hilang pada fragmen DNA, hanya amplifikasi linier yang terjadi. Dalam kasus yang paling menguntungkan, fragmen -fragmen tersebut dapat saling mematuhi, tetapi hasilnya akan kecil dan di bawah tingkat deteksi.
(B) Kehilangan basis, terutama karena depurinasi dan pembentukan dimer timidin, menyebabkan penurunan jumlah ikatan-H dan penurunan TM. Selama fase pemanasan yang memanjang, primer akan meleleh dari matriks DNA dan tidak akan merayap bahkan dalam kondisi yang kurang ketat.
(C) Basis timin yang berdekatan membentuk dimer TT.
Masalah umum lain yang sering terjadi dalam diagnostik molekuler adalah pelepasan asam nukleat target yang kurang optimal dibandingkan dengan ekstraksi fenol-kloroform. Dalam kasus ekstrem, ini dapat dikaitkan dengan negatif palsu. Banyak waktu dapat dihemat dengan lisis mendidih atau pencernaan enzimatik puing -puing sel, tetapi metode ini sering menghasilkan sensitivitas PCR rendah karena pelepasan asam nukleat yang tidak memadai.

Penghambatan aktivitas polimerase selama amplifikasi

Secara umum, penghambatan digunakan sebagai konsep kontainer untuk menggambarkan semua faktor yang mengarah pada hasil PCR suboptimal. Dalam pengertian biokimia yang ketat, penghambatan terbatas pada aktivitas enzim, yaitu, mengurangi atau mencegah konversi produk-substrat melalui interaksi dengan situs aktif DNA polimerase atau kofaktornya (misalnya, Mg2+ untuk TAQ DNA polimerase).
Komponen dalam sampel atau berbagai buffer dan ekstrak yang mengandung reagen dapat secara langsung menghambat enzim atau menjebak kofaktornya (misalnya EDTA), sehingga menonaktifkan polimerase dan pada gilirannya menyebabkan hasil PCR negatif yang menurun atau palsu.
Namun, banyak interaksi antara komponen reaksi dan asam nukleat yang mengandung target juga ditetapkan sebagai 'inhibitor PCR'. Setelah integritas sel terganggu oleh isolasi dan asam nukleat dilepaskan, interaksi antara sampel dan larutan sekitarnya dan fase padat dapat terjadi. Misalnya, 'pemulung' dapat mengikat DNA untai tunggal atau ganda melalui interaksi non-kovalen dan mengganggu isolasi dan pemurnian dengan mengurangi jumlah target yang akhirnya mencapai bejana reaksi PCR.
Secara umum, inhibitor PCR hadir di sebagian besar cairan tubuh dan reagen yang digunakan untuk tes diagnostik klinis (urea dalam urin, hemoglobin dan heparin dalam darah), suplemen makanan (komponen organik, glikogen, lemak, ion Ca2+) dan komponen di lingkungan (fenol, logam berat)

Inhibitor PCR yang lebih umum dapat ditemukan pada bakteri dan sel eukariotik, DNA non-target, makromolekul pengikat DNA dari matriks jaringan dan peralatan laboratorium seperti sarung tangan dan plastik. Pemurnian asam nukleat selama atau setelah ekstraksi adalah metode yang disukai untuk menghilangkan inhibitor PCR.
Saat ini, berbagai peralatan ekstraksi otomatis dapat menggantikan banyak protokol manual, tetapi pemulihan 100% dan/atau pemurnian target belum pernah tercapai. Inhibitor potensial mungkin masih ada dalam asam nukleat yang dimurnikan atau mungkin sudah berlaku. Ada strategi yang berbeda untuk mengurangi dampak inhibitor. Pilihan polimerase yang sesuai dapat memiliki dampak yang signifikan pada aktivitas inhibitor. Metode lain yang terbukti untuk mengurangi penghambatan PCR meningkatkan konsentrasi polimerase atau menerapkan aditif seperti BSA.
Penghambatan reaksi PCR dapat ditunjukkan dengan penggunaan kontrol kualitas proses internal (IPC).
Perawatan harus diambil untuk menghapus semua reagen dan solusi lain dalam kit ekstraksi, seperti etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol dan fenol, dari isolasi asam nukleat dengan langkah pencucian yang menyeluruh. Tergantung pada konsentrasi mereka, mereka dapat mengaktifkan atau menghambat PCR.